2019年5月26日Active Motif 推出相应的ELISA试剂盒(Global DNA Methylation LINE-1 Kit Cat# 55018),另辟蹊径,选用以点代面的方式,通过检测LINE-1这个转座元件的甲基化水平来...
货号: | 14043 |
CAS号: | 详询 |
供应商: | ActiveMotif |
数量: | 大量 |
英文名: | MS-275 |
保质期: | 详询 |
保存条件: | 详询 |
规格: | 5mg |
http://www.activemotif.com/catalog/990/activators-inhibitors
ActiveMotif公司是一家致力于研发和生产核细胞分子生物学和表观遗传学研究用试剂的专业公司,也是世界上最大的转录因子试剂生产商和CHIP-seq外包服务供应商。
ActiveMotif的产品涉及:表观遗传学相关抗体、Chip级别抗体、重组识别子和催化酶、预甲基化修饰的重组组蛋白、多聚核小体和生物素标记核小体;以及各类染色质分析、转录因子表达调控分析和DNA甲基化分析的试剂盒等。
不仅如此,ActiveMotif还为研究者提供专业的表观遗传学服务,特别是Chip-seq的外包服务。

DNA甲基化是重要的表观遗传修饰,在生长发育,环境响应和疾病发生,特别是肿瘤发生过程中,都起着重要的作用。DNA甲基化检测的方法有很多,如何选择更适合你研究目的方法呢?下面我们就来聊一聊常见的甲基化检测方法。
根据检测目的,DNA甲基化检测可以分为:根据检测目的,DNA甲基化检测可以分为:
1.Global DNA methylation assay
2.Gene-specific methylation assay
3.Whole genome(Genome-wide)DNA methylation assay
Global DNA methylation 和 Whole genome DNA methylation 检测有什么区别呢? 简单来说,Global DNA methylation 只需要了解的是整体的DNA甲基化水平的变化,而不关注哪些位点发生变化,而Whole genome DNA methylation关注的是在基因组范围内,各个区域甲基化修饰变化的水平。
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首先我们聊一聊Global DNA methylation
事实上在哺乳动物中,整体的DNA甲基化水平的剧烈变化出现在配子形成期和胚胎的发育早期,肿瘤发生以及一些药物处理也会影响整体DNA甲基化水平,但体细胞在大多数情况下DNA整体的甲基化水平还是比较平稳的。因而选择整体的甲基化水平检测时,还是要预先判断一下。
1.质谱:虽然是早期用的比较多的方法,但是做为整体甲基化检测的“金标准”还是要提一下,据说可以检测到0.25%的甲基化差异,优点很多,精确,重复性高,样品需求量少,但仪器和操作的要求太高,一些对灵敏度要求高的文章中还在使用。
2.ELISA: 简单快速高通量的检测方法。原理很简单,将DNA片段化后结合在96孔板上,用anti-5mC抗体检测5mC修饰,然后通过有HRP的二抗进行识别显色,各个公司都有出相应的试剂盒,不过有文章认为,这种方法适用于检测相对较大的甲基化差异。
Active Motif 推出相应的ELISA试剂盒(Global DNA Methylation LINE-1 Kit Cat# 55018),另辟蹊径,选用以点代面的方式,通过检测LINE-1这个转座元件的甲基化水平来判断整体甲基化水平,用生物素标记的LINE-1 probe捕捉DNA 片段,结合到链霉亲和素包被的96孔板上,进行后续的检测。LINE-1重复序列占人类基因组序列的17%~18%, 常被用作检测整体甲基化水平的标志物,有研究显示,用bisulfite处理结合焦磷酸测序检测LINE-1的甲基化水平与用HPLC检测的DNA整体甲基化水平高度相似。这种以点代面的方式能够更精确的反映DNA整体甲基化的水平,LINE-1试剂盒可以检测出0.5%的甲基化差异,起始样品量可低至10ng。不过局限在于,由于LINE-1序列存在物种差异,这个试剂盒目前只能用于人类样本的检测。
3.LUMA (luminometric methylation assay): 也是在文献中经常见到的一个检测整体DNA甲基化的方法。它是通过焦磷酸测序,检测甲基化敏感与不敏感的两种限制性内切酶对DNA的酶切效果的差异来衡量整体DNA甲基化水平的。5‘-CCGG-3’序列在人类基因组的所有CpG位点中约占8%,这些位点常在CpG岛内。MspI(甲基化不敏感)可以剪切有5mC,5hmC和无修饰的5‘-CCGG-3’,而HpaII(甲基化敏感)只酶切无修饰的位点,两组样品分别用两种酶处理,产生5′-CG末端,同时都以甲基化不敏感且酶切位点分布广泛的EcoRI进行酶切,产生5′-AATT末端作为内参,后续用DNA聚合酶补齐末端并利用焦磷酸测序检测反应过程中C/G和A/T的用量,就可轻易推算出整体DNA甲基化水平为:1-[(HpaII(G)/EcoRI(T))/(MspI(G)/EcoRI(T))]X100。LUMA检测不受物种限制,并可以进行物种间的比较,快速高通量,不过它需要焦磷酸测序平台,对DNA提取方法有一定要求,另外它只能覆盖部分CpG位点。
Gene-specific methylation assay和Whole genome(Genome-wide)DNA methylation assay
其实前期的样品处理方法是一样的,差别在于后续使用PCR/qPCR等方式检测特定位点的甲基化水平,还是通过芯片或NGS检测,来获得基因组范围内的信息。
根据样品的处理方法,可分为:
bisulfite处理
DNA 甲基化位点富集处理
限制性内切酶处理
1.Bisulfite(重亚硫酸盐)处理:
也是DNA甲基化研究中经典方法了,通过bisulfite 处理,将没有甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶,通过后续检测,可以获得每个胞嘧啶位点上的甲基化修饰的百分比。它不局限于CpG位点,同样适用于含有non-CG甲基化的植物和真菌样品的研究。不过bisulfite处理的转换效率非常重要,目前商业化的bisulfite kit的转化效率都可以达到99%以上。转化效率可以通过加入spike-in DNA, 检测已知的非甲基化区域序列,在动物样本中检测non-CpG序列中胞嘧啶的转化情况来判断。Bisulfite处理最大的问题在于,它无法区分5mC和5hmC,有羟甲基化修饰的胞嘧啶也不会转化为尿嘧啶。
Active Motif 提供相应的Bisulfite Conversion Kit(55016)和可用于FFPE样本的FFPE Bisulfite Conversion Kit(55021)。
Bisulfite处理后,常用的检测gene-specific methylation的方法有以下几种:
PCR-Sequencing: 在关注位点设计引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆进质粒进行sanger测序,从而获得该区域每个胞嘧啶的甲基化百分率。在设计引物时要避免引物中含有CpG位点,可使用针对bisulfite处理的设计软件,如MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/)等进行设计。因为bisulfite 处理前常有DNA片段化处理,且bisulfite 处理本身就会引起DNA断裂,因而扩增片段一般在100-300bp的范围内,此外,大多数高保真酶,不能扩增含尿嘧啶的片段,使用时需特别确认。PCR扩增有时很困难,多扩增几管合并一下吧。也有人建议可以使用巢式PCR,但也要当心降低样品中的多样性。另外,要送多少个克隆进行测序呢,下图是Nucleic Acids Research一篇文章中送测序的克隆数量,个人认为至少要在20个左右,结果的可信度才比较高吧。
焦磷酸测序:也是先进行PCR扩增出100bp左右的片段,再用焦磷酸测序进行检测。比上面的方法节省了很多工作量,特别适用于异质性高的样品,如肿瘤样品,局限在于需要焦磷酸测序平台。
Methylation-Specific qPCR:是针对需要检测的CpG位点,设计两对引物,可以分别扩增有甲基化修饰(仍保留C)和无甲基化修饰(转化成U)的DNA 片段。通过比对2次qPCR反应的Ct值,来判断样品中该位点的甲基化水平。这个方法简单快速,但一次只能检验一两个甲基化修饰位点。
甲基化高分辨率熔解曲线(MS-HRM):原理是当CG含量和分布发生变化时,DNA的熔解曲线位置和Tm值都相应发生改变。通过对bisulfite处理后的样品进行qPCR检测,可以与已知甲基化水平的bisulfite处理后的标准品的熔解曲线对比,就能快速推断出样品中甲基化修饰的水平。这种检测可以高通量快速进行,被认为可应用于临床检测,不过对qPCR仪有一定要求,样品间不能出现温度差异,或后期进行计算校正。
Bisulfite处理后,常用的Whole genome(Genome-wide)DNA methylation assay有哪些呢?
Whole genome bisulfite sequencing (WGBS): 可以提供非常详尽的DNA甲基化修饰信息。最大的局限在于测序的成本和大量的数据分析。其实对于植物和真菌等这些基因组较小的样本来说,随着NGS价格的降低,WGBS还是一个比较经济的选择,可以快速获得差异修饰的位点,并从基因组层面上挖掘出更多的信息。但对于如人类样本这样的大基因组,如果按照测序深度为30倍来计算,那么你大概会得到8亿个reads,但基因组中,很可能只有很少一部分甲基化修饰发生改变,因而是否需要如此详细的信息是需要考量的。(Active Motif 有提供WGBS服务哟).
RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing):是通过限制性内切酶MspI酶切CCGG位点(Active Motif的RRBS服务,在用MspI酶切的同时,还使用TaqI酶切TCGG位点),从而富集CpG-rich的区域,再进行bisulfite 处理和测序。RRBS可以检测人类基因组中大约85%的CpG岛和约50%的启动子,从而降低检测成本与数据的分析量,更关注于功能相关的位点,但充分的酶切反应是需要保证的,另外,可能会出现个别检测区域在不同样本中出现缺失的状况。
甲基化芯片检测:基本的原理是在芯片上针对每一个检测位点同时存在两种probe,可以分别与bisulfite处理后的有甲基化修饰的DNA片段和无修饰的C转化成U的DNA片段结合,并通过后续的延伸反应过程中C/G和A/T的荧光信号,来判断检测位点的甲基化水平。常见的甲基化芯片如Humanmethylation 450K,可以检测超过45万个CpG位点,覆盖99%已知的人类基因,包括启动子,5‘UTR,部分基因编码区,3’UTR等等。不同的芯片在检测方法的细节和检测范围上有一定的差异,可以根据需求选择。不过目前甲基化芯片类产品主要集中于人和小鼠样本的检测。
2. DNA 甲基化位点富集处理:
是将DNA先片段化,使用MBD富集含有甲基化CpG的片段或者使用anti-5mC的特异性抗体来富集有5mC的片段(MeDIP),再对这些片段进行后续的检测。如Active Motif 的MethylCollector Ultra Kit(55005),就是通过MBD2b/MBD3L1蛋白复合物来捕捉含有5mCpG的双链DNA片段的,比单独使用MBD2的富集效率更高,起始样本量可低至1ng,并在3小时内完成实验。还有MeDIP Kit (55009)用于富集含有5mC的单链DNA片段。从使用上来说MBD的方法和MeDIP的差别不大,有研究显示,这两种方法在后续利用NGS检测CpG和non-CpG的甲基化水平时,数据的一致性高达99%,不过在针对含有non-CpG甲基化修饰的样品时,逻辑上还是更倾向于MeDIP的方法。
MBD和MeDIP富集处理之后,可以通过PCR/qPCR的方式,直接检测特定区域DNA片段富集倍数的差异,也可以通过NGS,在整个基因范围内检测这种差异。此外还可以结合bisulfite处理,获得在单碱基分辨率的DNA甲基化水平检测。
3. 限制性内切酶处理:
使用甲基化敏感和甲基化不敏感的限制性内切酶,分别酶切DNA样本,针对特定位点,在酶切位点两端设计引物,通过qPCR检测酶切产物,与无酶切处理的input DNA进行对比,可用来快速判断该位点是否存在甲基化修饰差异,这种方法需要检测位点有含有甲基化敏感的限制性内切酶酶切位点,另外要确保酶切反应完全。切酶还可以直接与NGS相结合,如,methyl-sensitive cut counting (MSCC),以及与芯片检测结合,如,Comprehensive high-throughput arrays for relative methylation (CHARM)等来进行基因组范围内的检测,这里就不一一展开啦。
除了对5mC的检测外,5hmC也有多种相应的检测方法,如使用anti-5hmC抗体,利用ELISA的方法检测整体的5hmC水平(Global 5-hmC Quantification Kit), 或进行hMeDIP(55010)富集, 也用以可特异性酶切5hmC修饰位点的限制性内切酶PvuRts1(55011)进行酶切相关的检测。此外,可以使用Tab-Seq的方法进行全基因组范围内的5hmC的修饰的检测,其原理是通过β葡萄糖基转移酶在5hmC上添加葡糖基团进行保护,利用TET酶将基因组中的5mC转化为5caC,通过bisulfite处理,将除葡萄糖基化的5hmC外的其它C都转化为U,通过NGS检测.
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