2019年5月26日Active Motif 推出相应的ELISA试剂盒(Global DNA Methylation LINE-1 Kit Cat# 55018),另辟蹊径,选用以点代面的方式,通过检测LINE-1这个转座元件的甲基化水平来...

DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，在生长发育，环境响应和疾病发生，特别是肿瘤发生过程中，都起着重要的作用。DNA甲基化检测的方法有很多，如何选择更适合你研究目的方法呢？下面我们就来聊一聊常见的甲基化检测方法。

根据检测目的，DNA甲基化检测可以分为：根据检测目的，DNA甲基化检测可以分为：
1.Global DNA methylation assay
2.Gene-specific methylation assay
3.Whole genome（Genome-wide）DNA methylation assay

Global DNA methylation 和 Whole genome DNA methylation 检测有什么区别呢? 简单来说，Global DNA methylation 只需要了解的是整体的DNA甲基化水平的变化，而不关注哪些位点发生变化，而Whole genome DNA methylation关注的是在基因组范围内，各个区域甲基化修饰变化的水平。
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首先我们聊一聊Global DNA methylation

事实上在哺乳动物中，整体的DNA甲基化水平的剧烈变化出现在配子形成期和胚胎的发育早期，肿瘤发生以及一些药物处理也会影响整体DNA甲基化水平，但体细胞在大多数情况下DNA整体的甲基化水平还是比较平稳的。因而选择整体的甲基化水平检测时，还是要预先判断一下。

1.质谱：虽然是早期用的比较多的方法，但是做为整体甲基化检测的“金标准”还是要提一下，据说可以检测到0.25%的甲基化差异，优点很多，精确，重复性高，样品需求量少，但仪器和操作的要求太高，一些对灵敏度要求高的文章中还在使用。

2.ELISA: 简单快速高通量的检测方法。原理很简单，将DNA片段化后结合在96孔板上，用anti-5mC抗体检测5mC修饰，然后通过有HRP的二抗进行识别显色，各个公司都有出相应的试剂盒，不过有文章认为，这种方法适用于检测相对较大的甲基化差异。
Active Motif 推出相应的ELISA试剂盒（Global DNA Methylation LINE-1 Kit Cat# 55018），另辟蹊径，选用以点代面的方式，通过检测LINE-1这个转座元件的甲基化水平来判断整体甲基化水平，用生物素标记的LINE-1 probe捕捉DNA 片段，结合到链霉亲和素包被的96孔板上，进行后续的检测。LINE-1重复序列占人类基因组序列的17%~18%, 常被用作检测整体甲基化水平的标志物，有研究显示，用bisulfite处理结合焦磷酸测序检测LINE-1的甲基化水平与用HPLC检测的DNA整体甲基化水平高度相似。这种以点代面的方式能够更精确的反映DNA整体甲基化的水平，LINE-1试剂盒可以检测出0.5%的甲基化差异，起始样品量可低至10ng。不过局限在于，由于LINE-1序列存在物种差异，这个试剂盒目前只能用于人类样本的检测。

3.LUMA (luminometric methylation assay): 也是在文献中经常见到的一个检测整体DNA甲基化的方法。它是通过焦磷酸测序，检测甲基化敏感与不敏感的两种限制性内切酶对DNA的酶切效果的差异来衡量整体DNA甲基化水平的。5‘-CCGG-3’序列在人类基因组的所有CpG位点中约占8%，这些位点常在CpG岛内。MspI（甲基化不敏感）可以剪切有5mC，5hmC和无修饰的5‘-CCGG-3’，而HpaII（甲基化敏感）只酶切无修饰的位点，两组样品分别用两种酶处理，产生5′-CG末端，同时都以甲基化不敏感且酶切位点分布广泛的EcoRI进行酶切，产生5′-AATT末端作为内参，后续用DNA聚合酶补齐末端并利用焦磷酸测序检测反应过程中C/G和A/T的用量，就可轻易推算出整体DNA甲基化水平为：1-[(HpaII(G)/EcoRI(T))/(MspI(G)/EcoRI(T))]X100。LUMA检测不受物种限制，并可以进行物种间的比较，快速高通量，不过它需要焦磷酸测序平台，对DNA提取方法有一定要求，另外它只能覆盖部分CpG位点。

Gene-specific methylation assay和Whole genome（Genome-wide）DNA methylation assay
其实前期的样品处理方法是一样的，差别在于后续使用PCR/qPCR等方式检测特定位点的甲基化水平，还是通过芯片或NGS检测，来获得基因组范围内的信息。

根据样品的处理方法，可分为：
bisulfite处理
DNA 甲基化位点富集处理
限制性内切酶处理

1.Bisulfite（重亚硫酸盐）处理：
也是DNA甲基化研究中经典方法了，通过bisulfite 处理，将没有甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，通过后续检测，可以获得每个胞嘧啶位点上的甲基化修饰的百分比。它不局限于CpG位点，同样适用于含有non-CG甲基化的植物和真菌样品的研究。不过bisulfite处理的转换效率非常重要，目前商业化的bisulfite kit的转化效率都可以达到99%以上。转化效率可以通过加入spike-in DNA, 检测已知的非甲基化区域序列，在动物样本中检测non-CpG序列中胞嘧啶的转化情况来判断。Bisulfite处理最大的问题在于，它无法区分5mC和5hmC，有羟甲基化修饰的胞嘧啶也不会转化为尿嘧啶。
Active Motif 提供相应的Bisulfite Conversion Kit（55016）和可用于FFPE样本的FFPE Bisulfite Conversion Kit（55021）。

Bisulfite处理后，常用的检测gene-specific methylation的方法有以下几种：
PCR-Sequencing: 在关注位点设计引物进行PCR扩增，将扩增产物克隆进质粒进行sanger测序，从而获得该区域每个胞嘧啶的甲基化百分率。在设计引物时要避免引物中含有CpG位点，可使用针对bisulfite处理的设计软件，如MethPrimer （http://www.urogene.org/methprimer/）等进行设计。因为bisulfite 处理前常有DNA片段化处理，且bisulfite 处理本身就会引起DNA断裂，因而扩增片段一般在100-300bp的范围内，此外，大多数高保真酶，不能扩增含尿嘧啶的片段，使用时需特别确认。PCR扩增有时很困难，多扩增几管合并一下吧。也有人建议可以使用巢式PCR，但也要当心降低样品中的多样性。另外，要送多少个克隆进行测序呢，下图是Nucleic Acids Research一篇文章中送测序的克隆数量，个人认为至少要在20个左右，结果的可信度才比较高吧。



焦磷酸测序：也是先进行PCR扩增出100bp左右的片段，再用焦磷酸测序进行检测。比上面的方法节省了很多工作量，特别适用于异质性高的样品，如肿瘤样品，局限在于需要焦磷酸测序平台。

Methylation-Specific qPCR：是针对需要检测的CpG位点，设计两对引物，可以分别扩增有甲基化修饰（仍保留C）和无甲基化修饰（转化成U）的DNA 片段。通过比对2次qPCR反应的Ct值，来判断样品中该位点的甲基化水平。这个方法简单快速，但一次只能检验一两个甲基化修饰位点。

甲基化高分辨率熔解曲线（MS-HRM）：原理是当CG含量和分布发生变化时，DNA的熔解曲线位置和Tm值都相应发生改变。通过对bisulfite处理后的样品进行qPCR检测，可以与已知甲基化水平的bisulfite处理后的标准品的熔解曲线对比，就能快速推断出样品中甲基化修饰的水平。这种检测可以高通量快速进行，被认为可应用于临床检测，不过对qPCR仪有一定要求，样品间不能出现温度差异，或后期进行计算校正。



Bisulfite处理后，常用的Whole genome（Genome-wide）DNA methylation assay有哪些呢？

Whole genome bisulfite sequencing (WGBS): 可以提供非常详尽的DNA甲基化修饰信息。最大的局限在于测序的成本和大量的数据分析。其实对于植物和真菌等这些基因组较小的样本来说，随着NGS价格的降低，WGBS还是一个比较经济的选择，可以快速获得差异修饰的位点，并从基因组层面上挖掘出更多的信息。但对于如人类样本这样的大基因组，如果按照测序深度为30倍来计算，那么你大概会得到8亿个reads，但基因组中，很可能只有很少一部分甲基化修饰发生改变，因而是否需要如此详细的信息是需要考量的。（Active Motif 有提供WGBS服务哟）.

RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing):是通过限制性内切酶MspI酶切CCGG位点（Active Motif的RRBS服务，在用MspI酶切的同时，还使用TaqI酶切TCGG位点），从而富集CpG-rich的区域，再进行bisulfite 处理和测序。RRBS可以检测人类基因组中大约85%的CpG岛和约50%的启动子，从而降低检测成本与数据的分析量，更关注于功能相关的位点，但充分的酶切反应是需要保证的，另外，可能会出现个别检测区域在不同样本中出现缺失的状况。

甲基化芯片检测：基本的原理是在芯片上针对每一个检测位点同时存在两种probe,可以分别与bisulfite处理后的有甲基化修饰的DNA片段和无修饰的C转化成U的DNA片段结合，并通过后续的延伸反应过程中C/G和A/T的荧光信号，来判断检测位点的甲基化水平。常见的甲基化芯片如Humanmethylation 450K，可以检测超过45万个CpG位点，覆盖99%已知的人类基因，包括启动子，5‘UTR，部分基因编码区，3’UTR等等。不同的芯片在检测方法的细节和检测范围上有一定的差异，可以根据需求选择。不过目前甲基化芯片类产品主要集中于人和小鼠样本的检测。

2. DNA 甲基化位点富集处理：

是将DNA先片段化，使用MBD富集含有甲基化CpG的片段或者使用anti-5mC的特异性抗体来富集有5mC的片段（MeDIP），再对这些片段进行后续的检测。如Active Motif 的MethylCollector Ultra Kit（55005），就是通过MBD2b/MBD3L1蛋白复合物来捕捉含有5mCpG的双链DNA片段的，比单独使用MBD2的富集效率更高，起始样本量可低至1ng，并在3小时内完成实验。还有MeDIP Kit (55009)用于富集含有5mC的单链DNA片段。从使用上来说MBD的方法和MeDIP的差别不大，有研究显示，这两种方法在后续利用NGS检测CpG和non-CpG的甲基化水平时，数据的一致性高达99%，不过在针对含有non-CpG甲基化修饰的样品时，逻辑上还是更倾向于MeDIP的方法。

MBD和MeDIP富集处理之后，可以通过PCR/qPCR的方式，直接检测特定区域DNA片段富集倍数的差异，也可以通过NGS，在整个基因范围内检测这种差异。此外还可以结合bisulfite处理，获得在单碱基分辨率的DNA甲基化水平检测。


3. 限制性内切酶处理：

使用甲基化敏感和甲基化不敏感的限制性内切酶，分别酶切DNA样本，针对特定位点，在酶切位点两端设计引物，通过qPCR检测酶切产物，与无酶切处理的input DNA进行对比，可用来快速判断该位点是否存在甲基化修饰差异，这种方法需要检测位点有含有甲基化敏感的限制性内切酶酶切位点，另外要确保酶切反应完全。切酶还可以直接与NGS相结合，如，methyl-sensitive cut counting (MSCC)，以及与芯片检测结合，如，Comprehensive high-throughput arrays for relative methylation (CHARM)等来进行基因组范围内的检测，这里就不一一展开啦。

除了对5mC的检测外，5hmC也有多种相应的检测方法，如使用anti-5hmC抗体，利用ELISA的方法检测整体的5hmC水平（Global 5-hmC Quantification Kit）, 或进行hMeDIP（55010）富集, 也用以可特异性酶切5hmC修饰位点的限制性内切酶PvuRts1（55011）进行酶切相关的检测。此外，可以使用Tab-Seq的方法进行全基因组范围内的5hmC的修饰的检测，其原理是通过β葡萄糖基转移酶在5hmC上添加葡糖基团进行保护，利用TET酶将基因组中的5mC转化为5caC，通过bisulfite处理，将除葡萄糖基化的5hmC外的其它C都转化为U，通过NGS检测.

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